Western Blot中关于抗体的相关问题！

Western Blot中关于抗体的相关问题！

1、做细胞信号传导，要做磷酸化某因子Western Blot，其二抗有何要求？

解答：对二抗无要求，要看你实验条件来选择，一般用HRP标记的二抗。

2、同一公司的不同抗体用某个稀释度对一种抗体效果好，另外一种抗体可不可以用同种稀释度进行稀释？
解答：不同抗体，即使是同一公司的抗体，其*的抗体稀释度也是不一样的，需要进行实验摸索。
 

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3、免疫组化和Western Blot可以用同一种抗体吗？
解答：免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。（限于单抗）

4、Western Blot 中抗体的重复应用问题
解答：抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2－3次。稀释后应在2－3天内使用，4℃保存，避免反复冻融。

5、做western每次只加一种一抗，可以同时加两种或者多种一抗的吗？
解答：还是不要同时加两种一抗。因为如果结果里面有非特异信号的话，就说不清楚了。做Western在同一张膜上检测目的蛋白和内对照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗，ECL显色、压片、洗片；漂洗以后，再上内对照的一抗、二抗，ECL显色、压片、洗片。 

6、酶显色与荧光显色之间，各自的优缺点是什么？
解答：免疫酶技术就是用酶（如辣根过氧化物酶）标记已知抗体（或抗原），然后与组织标本在一定条件下反应，如果组织中含有相应抗原（或抗体），抗原抗体相互结合形成的复合物中所带酶分子遇到底物时，能催化底物水解、氧化或还原，产生显色反应，这样就可以识别出标本抗原（抗体）分布的位置和性质，通过图像分析并可达到定量的目的。

免疫荧光技术虽已广泛应用于免疫学的研究与诊断，但是荧光抗体染色标本不能保存，对组织细胞的细微结构分辨不清，免疫酶技术则能克服上述不足，标记免疫酶技术的敏感性更优于免疫荧光法，对石蜡切片标本尤为适用，为免疫病理研究开辟了一条新途径，酶显色产物具有较高的电子密度，经过适当处理还可以进行免疫电镜观察，免疫酶组化技术分为酶标记法与非标记抗体技术，前者是将酶通过交联剂结合在抗体分子上，形成酶标记抗体。后者是将酶作为抗原与相应的特异性抗体连接进行的免疫反应，称为非标记抗体酶技术。

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