非血红素铁检测试剂盒（红菲咯啉比色法）使用方法

信帆生物主营产品: 质控品，干扰物质，抗体抗原，elisa试剂盒，动物血制品，生化试剂盒等。实验代做服务：HE染色/特殊染色/技术服务、免疫组化实验服务、Western blotting实验服务、RT-PCR实验技术服务,QPCR(荧光定量PCR）、酶联免疫ELISA、生化测试、液相气相检测等

产品名称：非血红素铁检测试剂盒（红菲咯啉比色法）

货号：XJC5230

规格：50T

储存条件：2-8℃

有效期：6个月

产品简介

非血红素铁检测试剂盒与总铁测定方法相似，但样品须经酸和热处理，经离心后非血红素铁释放到上清液中，而含血红素铁的蛋白则留在沉淀中。其测定原理是动物组织或细胞经组织消化液在酸性加热条件处理后，经离心可分离出血红素铁和非血红素铁，非血红素铁再被还原剂还原为二价铁后与红菲咯啉生成红色化合物，在 500~550nm 有强吸收，可通过酶标仪或分光光度计测定。该试剂仅用于科研领域，不适用于临床诊断或其他用途。

产品组成

自备材料

1、蒸馏水或 PBS、分光光度计、比色皿、恒温箱或水浴锅、三氯乙-酸、盐酸

2、精密天平、离心管、剪刀、震荡器或摇床、离心机、试管、匀浆器

样本处理

A.组织样本处理

1、1.5ml 离心管称重，称取 100mg 左右的组织放入已称重的离心管中，再次称重，两次相减得到组织净重。

2、组织消化液的制备：用10g三氯乙-酸直接加入100ml  0.4mol/L 盐酸溶液，混匀后转入棕色试剂瓶，室温避光待用。

 如果没有0.4mol/L盐酸溶液，也可以用浓盐酸。在干净的烧杯中先加约 60–70 mL 蒸馏水，然后加入 10g三氯乙-酸，轻轻摇晃 / 搅拌至溶解。用移液管缓慢加入3.3ml 37%浓盐酸（注意放热、酸雾）。  加蒸馏水定容到 100 mL，颠倒混匀。转入棕色试剂瓶，室温避光保存。

向离心管中加入 1ml 以上组织消化液，65℃消化不少于 20h，期间用震荡器震荡 3~5 次，每次不少于10min，确保组织消化；消化完成后用组织消化液定容至 1.5ml，10000rpm 离心 5min，将管壁及盖子上的液体取下，取上清液转移至新离心管，混合备用。

B.细胞样品处理

培养细胞经消化后计数（浓度调整为 0.5 ~ 1×10⁶/ml），加入等体积的蒸馏水或 PBS 匀浆；匀浆液与组织消化液按 1:5 比例混合，90℃消化 30min，确保细胞消化；冷却后 10000rpm 离心 5min，将管壁及盖子上的液体取下，取上清液转移至新离心管，备用。

操作步骤（仅供参考）

1、配制铁显色工作液

将菲啰啉溶液、TGA 溶液、乙酸钠溶液按照3:3:5的体积比混合，配制成铁显色工作液，该溶液需现配现用。

2、配制系列铁标准液

先将铁标准储液 (100μg/ml) 用蒸馏水稀释至 20μg/ml，再按如下表格梯度稀释，配制不同浓度的铁标准液：

3、加样操作

取无铁污染的干净比色管，设置空白管、标准管、测定管，按如下表格依次加液，避免产生气泡；若样品铁含量过高，可减少样品用量或适当稀释后测定，样品检测建议设置 2 个平行管，最终结果取平均值。

4、吸光度测定

加液完成后充分混匀，室温显色 10min；以空白管 1 调零，用分光光度计在 535nm 波长处，分别测定空白管 2、系列标准管、测定管的吸光度，记为空白、标准、测定。

注意：比色皿使用前用待测液润洗2-3次，避免交叉污染；检测时比色皿透光面需擦拭干净，避免指纹、污渍影响读数；每个样品/标准管测3次，取平均值。

5.结果计算

以系列铁标准液的浓度（2、5、10、15、20μg/ml）为横坐标，对应吸光度为纵坐标，绘制标准曲线并求得回归方程，将测定管吸光度代入方程，计算样品消化液中的铁浓度；也可省略标准梯度，直接采用单标准比色测定，推荐选择 5μg/ml 或 10μg/ml 的铁标准液。

注意事项

1、操作所用器械、枪头、容器、比色皿等，需保证干燥、洁净，严格避免铁污染。

2、组织中非血红素铁含量差异较小，需对每个组织样本和离心管单独称重，国产离心管重量偏差较大，需重点注意。

3、试剂盒过期验证：取 10μl 铁标准储液 (100μg/ml)，加入 200μl 铁显色工作液，若溶液显深红色，说明试剂未过期，可继续使用。

4、试剂有效性判读：以空白管 1 为对照调零后，若空白，说明无铁污染，试剂可使用；若空白，说明组织消化液存在铁污染。

5.组织消化液配制时候，如果用到浓盐酸，请务必按照规定小心操作。

6.试剂产品含有酸性溶液及有一定腐蚀性，请在实验操作中务必穿戴好实验服，带好防护面罩和实验手套等，做好实验防护，严禁直接接触试剂。试剂开封后，请尽快使用，以免影响后续实验结果。